Механизам на апоптоза на човековите моноцитични леукемични клетки U937 индуцирана од печурката Hericium erinaceus (Yamabushitake)
Food Funct., 2011, 2, 348
Фитохемикалиите од одредена храна се потенцијален извор на биоактивни сигурни соединенија за хемопревенција на канцер и супресија на туморска иницијација, унапредување и метастазирање. Во оваа студија, евалуиравме екстракти со топла вода (HWE), 50% етанол на микробран (MWE), ациди (ACE) и алкалини (AKE) од плодното тело (спорокарп) на печурките Hericium erinaceus (Yamabushitake, Лавовска грива) за нивната способност да индуцираат апоптоза (програмирана клеточна смрт) кај човекови моноцитични леукемични клетки U937.
Се спроведоа клеточна култура, клеточна виабилност, цито- токсичност, проточна цитометрија, хромозомски ДНК интегритет, потенцијал на митохондриска мембрана, експресија на про- и анти- апоптични протеини и активација и анализи на инхибиција на каспаза што ќе помогнат да се дефинира механизмот на опсервираната апоптоза. Водените и водените/етанолските екстракти беа активни кај сите анализи, додека ацидните и алкалинските екстракти со слично приближен состав беа неактивни. Резултатите од био-анализите со активните екстракти се конзистентни со механизмот на апоптоза кој владее над супресијата на патеката на клеточна пролиферација што вклучува активација на каспаза-3 и каспаза-9 преку митохондриите, но не и на каспаза-8.
Проксимативната анализа на прашок од печурка, исушен во замрзнувач, покажа дека таа содржи високи количества протеини, јаглехидрати и минерали. Резултатите покажуваат дека печурките H. erinaceus може да имаат терапевтски потенцијал за леукемија кај луѓето.
Вовед
Hericium erinaceus, што во Јапонија се вика Yamabushitake или Houtou во Кина, е печурка која се јаде и е лековита печурка од класата Aphyllophorales, Hydnaceae (Hericiaceae). Во една претходна студија, покажавме дека двата екстракта подготвени од плодот на Hericium erinaceus нагорно го регулираa создавањето на азотен оксид (NO) и фагоцитозатa на макрофагите RAW264.7 кај глушец, сугерирајќи можно анти-канцерозно дејство преку аугментација на имунитетот на домаќинот. Да се постават наодите опишани подолу во соодветна перспектива, прво накратко ќе ги споменеме селектираните опсервации од извештаитe за анти-канцерогени и терапевтски аспекти на печурките по хронолошки редослед.
Воден екстракт од печурките Шиитаке (Lentinus edodes) индуцираше апоптоза на клетките U937 поврзани со намалено создавање на IL-1. Етанол екстракти од мицелиум на Lentinula edodes значително ја намали пролиферацијата и индуцираше апоптоза кај муринските клетки на карцинома на кожа (CH72) преку транзиентен G1 застој. Лектин од печурка индуцираше апоптоза на клетките U937 преку G2/M застој на клеточниот циклус поврзан со нагорна регулација на експресијата на p21/Waf1, намалување на експресијата на Bcl-2, забрзано испуштање на цитохром-c од митохондриите кон цитоплазмата и активирање на каспаза-9 кај третираните клетки. Полисахаридна изолирана форма на H. erinaceus нагорно ги регулираше функционалните настани пренесени преку макрофагите кај клетките RAW264.7, како создавање на азотен оксид (NO) и експресија на цитокини (IL-1b и TNF-a). Прочистен полисахарид од плодно тело на H. erinaceus забрза апоптоза индуцирана од доксорубицин кај човекови хепатокарцинома клетки, преку сензитивизација на апоптично сигнализирање од доксорубицин, намалувајќи ја експресијата на c-FLIP. Убиквинон-9 изолиран од екстракт на хлороформ од печурката Pleurotus eryngii индуцираше апоптоза на клетките U937 преку фрагментација на ДНК во апоптична скала на ДНК и инхибиција на дејството на топоизомераза. Мицелиум од H. erinaceus додаден на исхраната на глушец индуцираше анти-инфламаторни ефекти преку елевација на нивото на плазма глутатион (GSH) и амелиорација на хепатален оксидативен стрес. Мажи и жени од Јапонија, на возраст од 50-80 години беа дозирани со 250 мг капсули со H. erinaceus имаа подобрување на блага когнитивна попреченост, сугерирајќи дека печурките може да помогнат за спречување на деменција. Обработката, а не условите на одгледување, влијае врз антимикробниот и антиоксидативниот потенцијал на H. erinaceus.
Главната цел на оваа студија беше да се одреди проксимативниот состав на екстракти од плодното тело на печурките H. erinaceus и подетаљно да се испитаат механичките аспекти поврзани со супресија на пролиферацијата на клетките U937 по пат на индукција на апоптоза преку активирање на интринзичната патека на каспазата преку митохондриите.
Резултати
Состав на печурките
За да се поттикне интерес за употребата на H. erinaceus во исхраната, го одредивме приближниот состав на прашокот од печурки, исушен со замрзнување.
Табела 1. Приближен состав на четири екстракти од H. erinaceus (% сува тежина)
|
Примерок
|
Суров
протеин
|
CHO
|
Сурова
пепел
|
Влага
|
Сурови
влакна
|
|
HWE |
38.2 |
37.2 |
16.0 |
7.53 |
0.56 |
|
MWE |
37.6 |
39.5 |
14.6 |
6.98 |
0.73 |
|
ACE |
35.5 |
35.9 |
18.3 |
8.51 |
1.01 |
|
AKE |
36.9 |
33.84 |
19.0 |
8.36 |
0.98 |
Инхибиција на развој на клетките U937
За да се одреди дали HWE и MWE се цитотоксични, ја евалуиравме клеточната виабилност со анализа МТТ. Како внатрешна контрола, тестиравме и два екстракта (ACE и AKE) коишто не индуцираа создавање на NO. Третманот со HWE или MWE ја намали клеточната виабилност во зависност од дозата, додека ACE или AKE не беа цитотоксични. Овие податоци имплицираат можна вклученост на HWE или MWE во апоптозата на клетките U937.
Индукција на апоптоза на клетките U937
Спроведени се дополнителни експерименти за да се открие дали инхибицијата на развојот со HWE и MWE резултира од апоптична клеточна смрт. Прво, фракцијата на намачканата клеточна популација во различни квадранти се анализираше со проточна цитометрија. Делот на поединечни (FITC+, PI-) и двојно позитивни клетки (FITC+,PI+), сочинети од рано апоптични клетки и подоцнежни апоптични/некротични клетки, се зголеми до 54,5% и 54,7% од третманот со HWE и MWE, респективно. Нивоата на индукција беа близу оние третирани со етопозид, употребени како контрола за демонстрација на апоптоза.
Следно, го анализиравме интегритетот на геномската ДНК и соодносот на хиподиплоидни клетки. Третманот со HWE или MWE предизвика појава на хромозомна кондензација и апоптични тела, намачкувајќи ги со DAPI. Дигестијата на геномската ДНК во скала на интернуклеозомна фрагментација се забележа и кај клетките третирани со HWE и MWE. Шемите на дигестија беа слични на оние индуцирани од етопозидот.
Ги меревме и промените во соодносот на хиподиплоидните клетки кај третираните клетки со проточна цитометрија. Содржината на под-G1 ДНК на клетките U937 на 12. час со 500 mg mL-1 HWE или MWE изнесуваа 56% и 59,4%, респективно. Хиподиплоидните клетки што резултираа од третманите со HWE и MWE се зголемуваа во зависност од периодот. Овие податоци покажуваат дека HWE и MWE, но не и ACE и AKE, делуваат како поттикнувачи на апоптоза на клетките U937.
Експресија на про- и анти-апоптични протеини кај клетките U937
За да се испита апоптичната патека активирана од HWE и MWE, се анализираше експресијата на многу про- и анти-апоптични протеини со помош на анализата Western blot. И HWE и MWE значително ја инхибираа експресијата на анти-апоптичните протеини вклучувајќи ги Bcl-2, Bcl-xL(S), XIAP и cIAPs, додека нивоата на експресија на про-апоптичните, но не и на XIAP Bad, Bid и Bax, останаа виртуелно непроменети. Овие податоци сугерираат дека кај апоптозата инду-цирана од HWE или MWE преку интринзична сигнализирачка патека е вклучена надолна регулација на антиапоптични протеини, но не и нагoрна регулација на проапоптични протеини.
Редукција на MMP и испуштање на цитохром-c
Третманот на клетките со HWE и MWE доведе до значителен пад на про-апоптичниот цитохром-c кај митохондриите и истовремена појава на цитохром-c кај цитозол, сугерирајќи испуштање на цитохром-c од митохондриите во цитозолот. Третманите исто така значително го намалија нивниот MMP за 62,3 и 59,8%, респективно, споредливи нивоа со оние индуцирани од етопозидот. Овие податоци сугерираат дека HWE и MWE индуцираат апоптоза на клетките U937 прекупрекинување на интегритетот на митохондриската мембрана.
Активирање на каспази
Третманите со HWE и MWE значително ги зголемија дејствата на каспаза-9 (зголемување за 11,8 и 13 пати, респективно) и каспаза-3 (зголемување за 14,8 и 18,3 пати, респективно) во споредба со третираната група со другите екстракти. Се зголеми и дејството на каспаза-8. Меѓутоа, соодносот на индукцијата на дејството на каспаза-8 беше многу пониско од она на каспаза-3 и -9 (зголемување за 3,1 и 3,9 пати, респективно). Иако специфичностите на антигенското врзување на анти-каспазните-8 и -9 антитела не успеаја да детектираат сродни проформи, анализата Western blot покажува дека деградацијата на нивните проформи е клучна за експресија на ензимското дејство на каспаза-8 и -9 (каспази иницијатори) и каспаза-3 (каспази на ефект). Активирањето на каспаза-3 се појави паралелно со протеолитскиот процеп на PARP од 116 kDa негибнати молекули во фрагменти од 85 kDa. Индукцијата на апоптоза од HWE или MWE може во голема мера да се припише на иницирање на каспазата иницијатор, каспаза-9.
Супресија на индуцирана апоптоза од инхибиторот каспаза-3
За да се потврди дека апоптозата индуцирана од HWE или MWE се појавила со функција на ефект од каспаза-3, активирана главно од иницијаторната функција на каспаза-9, клетките беа претходно инкубирани со DEVDCHO, IETD-CHO и LEHD-CHO, инхибитори на каспаза-3, -8 и -9, респективно, пред третманот. Пре-третманот со инхибиторите на каспаза-3 или -9 ги намалија сродните ензимски дејства поефективно отколку со инхибиторот на каспаза-8. Активирањето на каспаза-3 преку деградација на нејзината проформа главно преку каспаза-9, игра клучна улога во апоптозата индуцирана од HWE и MWE.
Дискусија
Состав и нутритивност на печурките
Печурките се добар извор на протеини со добар квалитет, коишто содржат 19-40% протеини кај суви печурки. Основните амино-киселини кај повеќето видови се во иста пропорција како и кај јајцата.
Содржината на витамини е исто тoлку висока, слично како кај квасецот, со исклучок на тиамин. Откривме дека кај четирите екстракти на H. erinaceus, има високи количини на протеини, јаглехидрати и минерали, во опсег (во % од суви печурки) од 35,5 до 38,5; 33,8 до 39,5 и 14,6 до 19, респективно (Табела 1). Влажноста изнесуваше околу 8%, а влакна и масти, <1%. Ниско-калоричните печурки се добар извор на основните хранливи состојки и микронутриенси.
Фактот што водата и водените етанол екстракти се многу активни во сите биоанализи, додека соодветните ацидни и алкалински екстракти со сличен и приближен состав се неактивни, сугерира дека апоптичните соединенија не се стабилни на силни ацидни или алкалински услови.
Механизми на апоптозата – општи аспекти
Апоптозата се јавува според регулиран процес што вклучува активирање на клеточни настани што се карактеризираат со намалување на клетката, експресија на фосфатидилсерин на клеточната површина, кондензација на хроматинот, ДНК фрагментација и клеточна фрагментација во апоптичните тела. Фитохемикалиите може да индуцираат апоптоза и од интринзичните (митохондриски) и екстринзичните (рецептор на смрт) патеки. Интринзичната патека вклучува митохондриска пропустливост на надворешната мембрана и испуштање на про-апоптични фактори, додека екстринзичната патека вклучува интеракции помеѓу рецепторите на смрт на плазматичната мембрана и лигандите, што
понатаму ги активираат протеазите водејќи кон апоптична клеточна смрт. За индукција на апоптоза, екстринзичните и интринзичните патеки споделуваат испуштање на цитохром-c и модулација на протеинските експресии од семејството на Bcl-2 во митохондриите.
Фактот дека екстракти од трици (бран) на црн ориз покажаа јаки антиоксидативни, антиинфламаторни и анти-канцорегени својства сугерира дека карциногенезата кај клетките може да е причинета и од оксидативен и инфламаторен стрес пренесен преку интегрираните сигнализирачки патеки Nrf2, NF-kBm и AP-1. Сигналот за апоптоза оди до нуклеусот преку интеракција на FasL, тумор некроза фактор a (TNF-a) и лиганд што индуцира апоптоза поврзан со тумор некроза факторот со нивните сродни рецептори во мембраната и последователнo активирање на рецепторот на смрт преку адапторни молекули и каспаза-8.
Во друга патека, митохондриското испуштање на цитохром-c во цитозолот иницира апоптоза од митохондриите. Во цитозолот, цитохромот-c води кон активирање на иницијаторот на апоптоза каспаза-9 врзувајќи се кон APAF-1. Потоа, aктивираната каспаза-9 ја припојува неактивната про-каспаза-3 на активната извршителна каспаза-3. Потоа, активираната каспаза-3 припојува неколку супстрати за каспаза-3 како поли (ADP-рибоза) полимераза (PARP) и D4-GDI. Ова
се координира со фрагментација на ДНК и морфолошки промени на целните клетки. Покрај тоа, протеинското семејство Bcl-2 учествува како клучeн регулатор на клеточната смрт и функциите или како активатори (Bax, Bcl-Xs, Bid и Bad) или како инхибитори [(Bcl-2 и Bcl-XL(S)] во контролата на клеточната смрт, што води кон туморигенеза.
Апоптогенетски механизми на екстракти од печурки
Сегашните наоди индицираат дека HWE или MWE имаа директни цитотоксични ефекти наспроти развојот на канцерозните клетки. Друга човекова леукемична клеточна линија на Т-клетки (Molt-4) беше исто така инхибирана на 47 и 44%, респективно, со третмани од 500 mg mL-1 HWE и MWE (Таб. 2). Меѓутоа, муринската леукемична клеточна линија (L1210), нормалниoт мурински фибробласт NIH-3T3 и човековите фибробластични клетки HGF-1 покажаа само 5-8%
намалување по изложеност на HWE или MWE. Иако не знаеме зошто HWE и MWE преференцијално индуцираа смрт на клетките од човечко потекло, една можност е дека смртта на селективни канцерозни клетки може да е поврзана со индукција на создавање на NO во целните клетки. Неколку студии покажаa дека селективната цитотоксичност се должи на ниското ниво на антиоксидантски ензими кај канцерозните клетки. Ваквите клетки нудат компетитивна предност за формација на токсичен реактивен кислород и азотни видови. Ако капацитетот на антиоксидансите стане фатално лимитирачки, тогаш оксидативниот или азотниот стрес може да покаже цитотоксични ефекти врз ракот, но не и врз нормалните клетки.
Следниве опсервации го поткрепуваат заклучокот дека индуцираната цитотоксичност на специфични канцерозни клетки од третмани со HWE или MWE функционира преку апоптоза. Прво, проточната цитометрија на клетките Annexin V покажаа рапидна транслокација и акумулација на мембрански фосфатодилсерин од внатрешната кон надворешната страна на мембранскиот лист. Второ, употребата на третирани клетки означени со DAPI открија појава на нуклеуси со
згуснат хроматин и апоптични тела. Трето, третманите предизвикаа дигестија на геномската ДНК во ДНК-скалите на околу 200 основни парови. Четврто, проточната цитометрија на ДНК-профилите на третираните клетки покажа зголемена акумулација на хиподиплоидни клетки во фазата под-G1. На крај, шемата на застој на клеточниот циклус кај овие клетки беше слична на онаа на контролата со етопозид. Една цел на оваа студија беше да се открие дали апоптоза индуцирана од HWE или MWE е поврзана со надолна регулација на Bcl-2, Bcl-xL и Bcl-xS, како и со други антиапоптични протеини, вклучувајќи ги XIAP и cIAPs. Како и што се очекуваше, третманите индуцираа забележителна надолна регулација на антиапоптични протеини од фамилијата Bcl-2. За разлика од ова, про-апоптичните нивоа на протеинот Bcl-2, вклучувајќи ги Bad, Bid и Bax, беа само маргинално изменети. Третманите исто така го зголемија и соодносот на (про-апоптиченпротеин)/(анти-апоптични протеини) и индуцираа губење на MMP, водејќи кон апоптоза поради мито-хондриска дисфункција.
Иако е тешко да се дефинира точната апоптична сигнална патека поради хемиската хетерогеност на секој испитан екстракт од H. erinaceus, сегашните податоци даваат докази за предоминантна вклученост на митохондриската патека преку активирање на „иницијаторната” каспаза-9. Податоците ја исклучуваат можноста дека и HWE и MWE индуцираат апоптоза од рецепторите на смрт поради неуспехот да се детектира процепниот производ на Bid и значително ниските нивоа на активноста на каспаза-8 во однос на онаа на каспаза-9.
Табела 2. Цитотоксичност на контролата (PBS средство) и четири екстракти од печурки (500 mg mL-1) наспроти нормален мурински фибробласт (NIH-3T3), нормален човечки фибробласт (HGF-1), мурински леукемични (L1210) и човечки леукемични (MOLT-4 и U-937) клеточни линии
Цитотоксичност (%)
|
Третман
|
NIH-3T3
|
HGF-1
|
L1210
|
MOLT-4
|
U-937
|
|
PBS |
0.0+-0.7 |
0.0+-2.4 |
0.0+-8.9 |
0.0+-8.9 |
0.0+-4.2 |
|
HWE |
8.6+-1.7 |
5.8+-1.6 |
8.8+-4.7 |
47.1+-4.8 |
67.9+-1.4 |
|
MWE |
8.7+-2.0 |
4.5+-2.2 |
8.8+-4.0 |
44.2+-0.8 |
69.6+-1.3 |
|
ACE |
1.3+-1.4 |
0.5+-0.7 |
1.7+-3.0 |
6.2+-8.6 |
5.4+-0.4 |
|
AKE |
5.1+-2.9 |
2.5+-5.3 |
5.6+-0.6 |
12.9+-0.9 |
8.4+-0.6 |
Според наведените резултати, ние предлагаме дека митохондриската апоптична патека иницирана од HWE и MWE ја активира „иницијаторната” каспаза-9, која пак ја активира каспаза-3. Транслокацијата индуцирана од HWE и MWE на испуштање на цитохром-c од митохондриите во цитозолот веројатно се должи на намалената експресија на анти-апоптични протеини без никакви сигнификантни промени во експресиите на про-апоптичните протеини. Овие настани потоа водат кон активирање на каспаза-9 и -3, заедно со истовремено процепување на PARP, но без забележително активирање на каспаза-8. Овој механизам е исто така поткрепен од понискиот инхибиторен ефект на инхибиторот на каспаза-8 врз когнитивното ензимско дејство во споредба со инхибицијата забележана кај инхибиторите на каспаза-3 и -9.
Заклучоци
Сегашните наоди покажуваат дека водените и екстрактите од вода/ етанол HWE и MHW на H. erinaceus кои индуцираат создавање на NO кај клетките макрофаги, силно ја супресираат пролиферацијата на U937, но не и на нормалните клетки преку индукција на апоптоза преку активирање на каспазната патека преку митохондриите.
Двата ацидни и алкални екстракти (ACE и AKE), коишто не индуцираа создавање на NO, беа неактивни во сите биоанализи, сугерирајќи дека активните состојки на печурката не се стабилни на јаки ацидни или основни услови. Нашите податоци покажуваат дека двата екстракта, HWE и MWE, на печурките H. erinaceus ги зголемија нивоата на про-апоптичниот протеин (Bax, Bad и Bid) во однос на апоптичните протеини {(Bcl-2, Bcl-xL(S) и cIAPs)}, а со тоа се подобри апоптозата на човековите леукемични клетки U937. Овие размислувања сугерираат дека за целите печурки или активните екстракти се потребни понатамошни студии за можниот терапевтски потенцијал против леукемија кај луѓето. На крај, оваа студија ги дополнува претходните опсервации за анти-канцерогениот потенцијал на соединенијата на други растенија, вклучувајќи ги гликоалкалоидите на компирите и доматите.
